高压细胞破碎仪厂家指导如何提取高质量的RNA

   高压细胞破碎仪厂家指导提取高质量的RNA的步骤如下：

1、细胞裂解

   细胞的获取方式不同，采用的裂解方法也不尽相同。

   若是组织中提取，按照每50-100mg样品加入1ml Trizol的比例加入Trizol，而后匀浆破碎样品。细胞破碎后在室温下静置5分钟，这样可以分离出核蛋白复合物（nucleoprotein complexes），然后离心去除细胞碎片。

   若是培养瓶中贴壁细胞，则先用冰PBS洗2次，而后按每10平方厘米区域加入1ml Trizol的比例加入Trizol, 吹打混匀处理。

   若是悬浮细胞，离心收集细胞，去除培养基，然后加入适量Trizol吹打混匀处理。

   可以发现这步操作主要用到了Trizol这个试剂。Trizol的主要成分是苯酚，是有效的蛋白变性剂。它能够抑制酶活性包括RNAaes，这样可以保证RNA不会被降解掉，同时Trizol能够使细胞裂解。

2、抽提RNA

   向EP管中的细胞液加入200ul氯仿，涡旋15秒后，室温静置3分钟，然后4℃，12000rpm,15min条件下离心。离心后分3层，上层为无色或淡粉色含有RNA，中层为白色含有DNA，下层为红色含有蛋白质和脂质。我们所需的RNA由于氯仿的作用就分在上层的水相中。

   氯仿是有机溶剂，添加氯仿会使细胞内的蛋白变性沉淀，可以通过离心进行去除。同时加入氯仿后，水相和有机相会分层，将水相中的酚抽提以免损伤核酸，另外还能溶解一些脂溶性杂质纯化RNA。

3、沉淀RNA

   吸取上层水相于新的EP管中，不要吸取中间层或下层的部分，加入等体积的异丙醇，一般是500ul上清和500ul异丙醇，少的时候可以取200ul的上清。两者充分混匀，室温放置10分钟,然后4℃，12000rpm离心10分钟。离心结束后，弃去上清，管底可见白色胶状沉淀，这就是RNA了。

4、洗涤RNA

   为了进行RNA的洗涤，需要用DEPC水配制75%的乙醇溶液，现配现用。DEPC水就是是用DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的MiliQ纯水，里面不含杂质RNA，DNA和蛋白质。

   按照添加的Trizon的量1:1体积配乙醇溶液，一般是750ul分析纯乙醇加上250ul DEPC水，在涡旋仪上使乙醇溶液与RNA充分混匀，4℃，9000rpm,5min离心。然后小心弃去上清，不要吸走管底的RNA哦。

5、再次洗涤RNA

   重复第四步骤，再次洗涤RNA，弃去上清后，控干EP管。室温下将EP管倒置在吸水纸上5-10min,酌情加入20-50ul DEPC水溶解RNA，这就是我们终提取到的RNA了。

6、测定RNA纯度&浓度

   用微量紫外分光光度计取1-2ul RNA检测即可。A260/A280值在1.8-2.0间符合纯度。RNA在260nm处有大吸收，A260=1.0代表RNA的浓度为40ug/ml。A280用于检测蛋白污染，纯RNA样品的A260/A280=2.1，一般所得比值在1.8-2.0间也是普遍认可的。另外，我们也可以测定A230。A230用于检测其他污染，主要来自RNA提取试剂，理想的A230值要大于1.5。另外RNA的完整性可以用1%的琼脂糖凝胶电泳验证。